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PCR體系中引物占有十分重要的地位

更新時間:2019-09-06      點擊次數(shù):3486

在整個PCR體系中,引物占有十分重要的地位。PCR的特異性要求引物與靶DNA特異結(jié)合,不與其他非目的的DNA結(jié)合,PCR的靈敏性要求DNA聚合酶能與引物進(jìn)行有效的延伸,可見引物設(shè)計好壞與PCR結(jié)果密切相關(guān)。

 

一、PCR引物設(shè)計原則

 

1、引物長度一般在15-30bp

引物長度一般為15-30bp,常用的為18-27bp,但不應(yīng)大于38bp,因為過長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃,不適于Taq DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng);

 

2、引物GC含量一般為40%-60%

引物GC含量一般為40%-60%,以45-55%為宜,GC含量過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物GC含量和Tm值要保持接近;

 

3、引物所對應(yīng)的模板序列的Tm值在72℃左右

Tm值在72℃左右可使復(fù)性條件*,至少要在55-80℃之間。Tm值的計算有多種方法,如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T),在Oligo軟件中使用的是鄰近法(the nearest neighbor method);

 

4、引物3’端的堿基一般不用A

引物3’端的堿基一般不用A,因為A在錯誤引發(fā)位點的引發(fā)效率相對比較高。

5、引物3’端出現(xiàn)3個以上的連續(xù)堿基,如GGG或CCC,也會使錯誤引發(fā)機(jī)率增加。

 

6、引物3’端的互補、二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。

 

7、如擴(kuò)增編碼區(qū)域,引物3’端不要終止于密碼子的第3位,因密碼子的第三位易發(fā)生簡并,會影響擴(kuò)增特異性與效率;

 

8、引物5’端可以修飾

引物5’端序列對PCR影響不太大,因此常用來引進(jìn)修飾位點或標(biāo)記物。

 

9、堿基要隨機(jī)分布,且引物自身和引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。

引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高,尤其是3’端相似性較高的序列,否則容易導(dǎo)致錯誤引發(fā)。降低引物與模板相似性的一種方法是,引物中四種堿基的分布是隨機(jī)的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。引物自身不應(yīng)存在互補序列,否則引物自身會折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)(Hairpin)使引物本身復(fù)性。這種二級結(jié)構(gòu)會因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補。兩引物之間也不應(yīng)具有互補性,尤其應(yīng)避免3’端的互補重疊以防止引物二聚體(Dimer與Cross Dimer)的形成。引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)如果不可避免的話,應(yīng)盡量使其△G值不要過高(應(yīng)小于4.5kcal/mol)。否則易導(dǎo)致引物二聚體帶的 產(chǎn)生,并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進(jìn)行。

 

10、引物的ΔG值呈正弦曲線形狀,即3’端ΔG值較低,而5’端和中間ΔG值相對較高。

ΔG值(自由能)反應(yīng)了引物與模板結(jié)合的強弱程度,一般情況下,引物的ΔG值呈正弦曲線形狀,即3’端ΔG值較低,而5’端和中間ΔG值相對較高。3'端的ΔG值相對要低,且值不要超過9,引物的3’端的ΔG值過高,容易在錯配位點形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。

 

11、引物應(yīng)在核酸保守區(qū)內(nèi)設(shè)計并具有特異性。引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性不要超過70%或有連續(xù)8個互補堿基同源。

 

二、Real Time PCR引物設(shè)計原則

 

Real Time PCR用引物與普通PCR引物設(shè)計要求不同。RealTime PCR是讓目的基因按照理論值進(jìn)行擴(kuò)增,對非特異性反應(yīng)和引物二聚體要求嚴(yán)格。

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